在医学领域中，样本的采集与保存是进行ELISA测定的关键步骤。可用作样本的范围相当广泛，包括各种体液（如血清）、分泌物（唾液）以及排泄物（如尿液、粪便）等。这些样本可以用来检测特定的抗体或抗原成分。某些样本如血清和尿液可以直接进行检测，而另一些样本如粪便和特定的分泌物则需要经过预处理。通常情况下，ELISA检测以血清作为主要样本来源。

血浆样本虽然包含纤维蛋白原和抗凝剂，其成分与血清相似，但制备过程需要添加抗凝剂，而血清样本仅需让血液自然凝固并收缩即可获得。在医学检验中，血清通常作为检测样本，虽然在ELISA检测中，血浆与血清可以相互替代。收集血清样本时，应遵循常规方法，避免溶血现象，因为红细胞溶解后会释放过氧化物酶活性物质，这可能导致以HRP为标记的ELISA检测中出现非特异性显色。因此，建议尽快在新鲜状态下检测血清样本。

如样本受到细菌污染，细菌内可能含有内源性HRP，也会引发假阳性反应。此外，存放过久的样本可能会发生聚合现象，在间接法ELISA中造成背景加深。一般而言，血清样本可在4℃下保存5天，超过一周则需冷冻保存。冷冻后的血清在溶解时，蛋白质会出现局部浓缩，分布不均，因此在检测前需充分混匀。注意操作时应避免产生气泡，混合时建议轻轻上下颠覆，而不要强烈振荡。若血清样本出现混浊或沉淀，需经过离心或过滤澄清后再进行检测。反复冷冻和解冻会使抗体效价降低，因此如需进行多次检测，最好将血清样本分装后存储。采集血清时要注意无菌操作，可以考虑加入适当的防腐剂。

在ELISA实验中，试剂的准备至关重要。需根据试剂盒说明书的指导准备实验所需的各种试剂。所用的蒸馏水或去离子水必须是新鲜优质的，自己配制的缓冲液需使用pH计进行测量，以确保准确性。试剂从冰箱中取出时，应等其温度与室温平衡后再使用。未使用的试剂应及时放回冰箱保存，以确保其有效性。

在ELISA过程中，一般有三次加样步骤：加入样本、加入酶结合物以及加入底物。在加样时，需将所用物质添加到ELISA板孔的底部，避免直接溅入孔壁，同时要注意不要产生气泡。加样时通常使用微量加样器，按照规定量加入样本，每次加样时需更换吸嘴，以防止交叉污染。若需使用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释比例进行稀释后再添加样本，或者在板孔中加入稀释液，再加入血清样本，使用微型震荡器震荡1分钟以确保充分混合。在加入酶结合物和底物时，可以采用定量多道加液器，加快加液过程。

在ELISA中，进行抗原与抗体反应通常分为两次，即在加入样本后和加入酶结合物后。这一反应需要在特定的温度和时间下完成，通常称为孵育。由于ELISA是一种固相免疫测定，抗原与抗体的结合只在固相表面发生。以夹心法为例，在板孔中添加的样本中，并不是所有抗原都有均等的机会与固相抗结合，只有最靠近孔壁的一层溶液中的抗原才能直接与抗体接触。因此，反应需要一定的时间和扩散才能达到平衡。ELISA实验中常用的温度有4℃、室温、37℃和43℃，其中37℃是实验室常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的理想温度。研究表明，在37℃下进行的两次抗原抗体反应时间为1-2小时，反应产物可达到最高峰。为了加快反应速度，可适当提高温度，但不宜超过43℃，更高的温度可能影响实验结果。虽然4℃下的反应更为彻底，但是由于时间较长，通常在ELISA实验中不会采用这一方法。

对于寻求实验准确性的科研人员而言， ag尊龙凯时倡导在ELISA相关实验中，严格遵循样本处理、试剂准备和加样步骤等环节，确保结果的可靠性与有效性。